Analisis Proksimat

MELAKUKAN ANALISIS PROKSIMAT

Kompetensi ini mencakup kemampuan melakukan pengujian / prosedur secara analisis proksimat yang diperlukan untuk menganalisisi berbagai mutu bahan/produk pangan. Analisis Proksimat meliputi  :

1.      Pengujian kadar air

2.      Pengujian kadar abu

3.      Pengujian kadar lemak

4.      Pengijian kadar protein

5.      Pengujian kadar serat

6.      Pengujian kadar karbohidrat

Peralatan dan fasilitas yang diperlukan :

a.      Peralatan untuk penyiapan sampel meliputi :

·         Mortar

·         Blender

·         Neraca analitik

·         Alat ukur volumetric

b.      Peralatan pengujian kadar air meliputi :

·         Neraca analitik

·         Cawan aluminium

·         Oven

·         Desikator

c.       Peralatan pengujian kadar abu meliputi :

·         Neraca analitik

·         Cawan porselen

·         Tanur listrik

·         Desikator

d.      Peralatan pengujian kadar lemak meliputi :

·         Neraca analitik

·         Soklet

·         Kondensor

·         Labu lemak

·         Desikator

·         Oven

e.       Peralatan pengujian kadar protein meliputi :

·         Neraca analitik

·         Labu kjeldahl

·         Alat-alat gelas (Erlenmeyer,buret, pipet volumetric, pipet tetes, labu ukur)

·         Destilator

·         Kondensor

·         Pemanas listrik

·         Destructor

f.        Peralatan pengujian serat kasar meliputi :

·         Neraca analitik

·         Pendingin tegak

·         Corong Buchner

·         Pompa vakum

·         Hot plate

·         Erlenmeyer

1.      PENGUJIAN KADAR AIR

Air bersifat tidak berwarna , tidak berasa, tidak berbau pada kondisi standar,yaitu pada tekanan 100 kPA (1 bar) dan suhu 273,15 K (0 °C). Air merupakan suatu pelarut yang penting, yang memiliki kemampuan untuk melarutkan banyak zat kimia lainnya, seperti garam-garam, gula, asam, beberapa jenis gas dan banyak macam molekul organic.

Table dibawah ini menunjukkan kandungan air dalam beberapa pangan :

NO	PRODUK PANGAN	KANDUNGAN AIR %
1.	Selada ( Lactusa sativa)	95
2.	kubis	95
3.	Jeruk	92
4.	Sari buah apel	87
5.	Susu	87
6.	Kentang	78
7.	Pisang	75
8.	Ayam	70
9.	Daging	65
10.	Keju	37
11.	Roti putih	35
12.	Madu	20
13.	Mentega dan Margarin	16
14.	Tepung-tepung	14
15.	Tepung gandum	12
16.	Beras	12
17.	Serbuk susu	4
18.	Shortening	0

Penentuan kadar air tergantung dari sifat bahan. Pada umumnya mengeringkan pada suhu 105 – 110 °C selama 3 jam atau sampai didapat berat konstan dalm oven. Selisih berat sebelum dan sesudah pengeringan adlah banyaknya uap air yang diuapkan.

Untuk bahan tidak tahan panas seperti yang berkadar gula tinggi, minyak, daging, kecap, dilakukan pada kondisi vacuum dengan suhu lebih rendah. Kadang – kadang peringatan di lakukan tanpa pemanasan, bahan dimasukan kedalam ksikator dengan H₂SO₄ pekat sebagai pengering hingga didapat berat konstan.

            Bahan dengan kadar air tinggi dan mengandung senyawa yang mudah menguap (seperti susu, sayuran) penentuannya dengan cara destilasi dengan pelarut tertentu misalnya toluene, xilol dan heptana yang berat jenisnya rendah. Contoh dimasukkan kedalam tabung bola kemudian dipanaskan. Air  dan pelarut menguap, di embunkan dan jatuh pada tabung Aufhuser yang berskala. Air yang mempunyai berat jenis tinggi berada dibawah sehingga dapat dibaca pada skala tabung Aufhuser tersebut.

            Untuk bahan dengan kadar gula tinggi, kadar airnya dapat diukur dengan menggunakan refraktometer disamping menentukan padatan terlarutnya pula. Dalam hal ini air dan gula dianggap sebagai komponen – komponennya yang mempengaruhi indeks refraksi.

1.      Penentuan kadar air cara pengeringan ( termogravimetri )

Prinsipnya menguapkan air yang ada dalam bahan dalam cara pemanasan. Bahan di timbang hingga berat konstan yang dapat diartikan semua air sudah teruapkan. Cara ini relativ mudah dan murah.

Penguapan dapat dipercepat dan reaksi yang menyebabkan terbentuknya air atau reaksi lain dapat di cegah dengan melakukan pemanasan pada suhu rendah dan tekanan vakum. Bahan – bahan yang mempunyai kadar gula tinggi akan mengalami pengerakan pada permukaan bahan bila dipanaskan pada suhu ± 100°C.

Suatu bahan yang telah mengalami pengeringan akan bersifat lebih higroskopis dari pada bahan asalnya. Selama pendinginan sebelum penimbangan,bahan harus slalu di tempatkan dalam ruang tertutup kering misalnya eksikator atau desikator yang telah diberi zat penyerap air. Penyerap air atau uap air yang dapat digunakan antara lain kapur aktif, silika gel, asam sulfat, aluminium oksida, kalium klorida, kalium hidroksida, kalium sulfat atau barium sulfat. Silika gel lebih sering digunakan karena memberikan perubahan warna saat jenuh dengan air / uap air.

2.      Penentuan kadar air cara destilasi ( thermovolumetri )

Prinsip penentuan kadar air dengan cara destilasi adalah menguapkan air dengan ‘pembawa’ cairan kimia yang mempunyai titik didih yang lebih tinggi dari pada air tetapi tidak bercampur dengan air serta mempunyai berat jenis lebih rendah dari pada air. Zat kimia yang sering digunakan anatara lain toluene, xylem, benzene, tetrakloroetilen dan xylol.

Cara ini baik untuk menentukan kadar air dalam zat yang mempunyai kadar air kecil sehingga sulit ditentukan secara termogravimetri. Oksidasi senyawa lipid atau dekomposisi senyawaan gula dapat di hindari dengan cara ini.

                                                                                                             

3.      Penentuan kadar air cara kimiawi

Penentuan kadar air di tentukan dengan titrasi Karl Fisher yaitu menitrasi sampel dengan larutan iodin dalam methanol, cara kalsium karbid yang didasarkan pada reaksi antara kalsium karbid dan air yang menghasilkan gas asetilen

4.      Penentuan kadar air dengan metode fisis

Penentuan kadar air dengan cara ini ditentukan dengan nerdasarkan tetapan dielektrikum, konduktifitas listrik ( daya hantar listrik ) dan resonansi nuklir magnetic ( NMR )

LEMBAR KERJA  I

A.     ANALISIS KADAR AIR DENGAN METODE OVEN

Metode                           :     Metode Oven. SNI 01 – 2891 – 1992 butir 5.1, cara uji makanan dan

                                             Minuman

Prinsip                            :     Kehilangan bobot pada pemanasan 105°C dianggap sebagai kadar

                                             Air yang terdapat pada sampel

Alat                                 :     1. Neraca analitik

                                             2. Botol timbang

                                             3. Spatula

                                             4. Oven

                                             5. Desikator

                                             6. krustang

Bahan                             :     1. Sampel bakso daging

Cara Kerja                      :

1.      Panaskan botol timbang pada oven pada suhu 105°C selama 1 jam

2.      Dinginkan dalam desikator selama ½ jam

3.      Timbang dan catat bobotnya

4.      Ulangi sampai diperoleh bobot konstan

5.      Timbang contoh sampel bakso daging sebanyak 1 – 2 gram pada botol timbang tertutup yang telah didapat bobot konstannya

6.      Panaskan dalam oven pada suhu 105°C selama 3 jam

7.      Dinginkan dalam desikator selama ½ jam

8.      Timbang botol timbang yang berisi contoh tersebut

9.      Ulangi pemanasan dan penimbangan hingga diperoleh bobot konstan

Perhitungan :

                  

                     ( Wo + Ws) - Wi

% Air  =                                            X 100

                              Ws

Wo     =   berat botol timbang kosong (gram)

Wi      =   berat botol timbang + sampel setelah pengeringan (gram)

Ws     =    berat sampel

Table data

Kode	Wo	Ws	Wi	% Air	Rata-Rata

B.     Analisis Kadar Air dengan Metode Destilasi

Metode                     :     Metode destilasi. SNI 01 – 2891 – 1992 butir 5.2, Cara Uji

                                       Makanan  dan minuman

Prinsip                      :     Pemisahan azeotropik air dengan pelarut organic

Alat                           :     1. Neraca analitik

                                       2. Labu didih 500 mL

                                       3. Alat Aufhauser

                                       4. Pemanas listrik

Bahan                       :     1. Sampel

                                       2. Xylol atau toluene

Cara Kerja                :

·         Timbang dengan seksama 5 – 10 gram  sampel, masukkan kedalam labu didih dan tambahkan 300 mL xylol serta batu didih

·         Sambungkan dengan alat aufhauser dan panaskan diatas pemanas listrik selama 1 jam dihitung sejak mulai mendidih. Setelah 1 jam matikan pemanas listrik dan biarkan alat aufhauser mendingin

·         Bilas alat pendingin dengan xylol murni atau toluene

·         Baca volume air

Perhitungan

                        V

% Air  =                                 X  100

                        W

W       =      berat contoh (gram)

V        =      volume air yang dibaca pada alat aufhauser (mL)

Table data

Kode	W	V	% Air	Rata-rata

       

          

2.      ANALISIS KADAR SERAT

Istilah serat makanan (dietary fiber) harus dibedakan dengan istilah serat kasar (crude fiber) yang biasa digunakan dalam analisa proksimat bahan pangan. Serat kasar adalah bagian dari pangan yang tidak dapat dihidrolisis oleh bahan-bahan kimia yamg digunakan untuk menentukan kadar serat kasar yaitu asam sulfat (H₂SO₄ 1,25 %) dan Natrium Hidroksida (NaOH 3.25%).sedangkan serat makanan adalah bagian dari pangan yang tidak dapat dihidrolisis oleh enzim-enzim pencernaan.

Serat yang tidak larut dalam air ada 3 macam yaitu sellulosa, hemiselulosa, dan lignin. Sedangkan serat yang larut dalam air antara lain pectin, musilase, dan lignin. Ada beberapa metode analisis serat yaitu :

1.      Metode crude fiber

2.      Metode deterjen

3.      Metode enzimatis

Metode analisis dengan menggunakan deterjen (acid deterjen fiber,ADF,atau neutral deterjen fiber, NDF) merupakan metode gravimetri yang hanya dapat mengukur komponen serat yang tidak  larut .

PENENTUAN SERAT KASAR

Didalam analisa penentuan serat kasar diperhitungkan banyaknya zat-zat yang tidak larut dalam asam encer atau basa encer dengan kondisi tertentu. Langkah-langkah dalam analisa :

v  Deffating yaitu menghilangkan lemak yang terkandung dalam sampel menggunakan pelarut lemak

v  Digestion terdiri dari dua tahap yaitu pelarutan dengan asam dan pelarutan dengan basa. Kedua macam proses digesti ini dilakukan dalam keadaan tertutup pada suhu terkontrol (mendidih) dan sedapat mungkin dihilangkan dari pengaruh luar.penyaringan harus segera dilakukan setelah digestion selesai,karena penundaan penyaringan dapt mengakibatkan rendahnya hasil analisa karena terjadi perusakan serat lebih lanjut oleh bahan kimia yang dipakai. Untuk bahan  yang banyak mengandung protein sering mengalami kesulitan dalam penyaringan , maka sebaiknya dilakukan digesti pendahuluan dengan menggunakan enzim proteolitik. Residu yang diperoleh dalam pelarutan menggunakan asam dan basa merupakanserat kasar yang mengandung  ± 97 % selulosa dan lignin. Serat kasar sangat penting dalam penilaian kualitas bahan makanan karena angka ini merupakan indeks dan menentukan nilai gizi bahan makanan. Selain itu kandungan serta kasar dapat digunakan untuk mengevaluasi suatu proses pengolahan,misalnya proses penggilingan atau proses pemisahan antara kulit dan kotiledon dengan demikian persentase serat kasar dapat dipakai untuk menentukan kemurnian bahan atau efisiensi suatu proses.

LEMBAR KERJA II

PENENTUAN SERAT KASAR

Metode                 :     SNI 01-2891 – 1992 butir 7.1, Cara uji makanan dan minuman

Prinsip                  :     Ekstraksi contoh dengan asam dan basa untuk memisahkan serat

                                   Kasar dan bahan lainnya

Alat                      :     1. Neraca analitik

                                   2. spatula

                                   3. Labu ukur 100 mL

                                   4. Corong Buchner

                                   5. Pipet tetes

                                   6. Gelas ukur

                                   7. Erlenmeyer

                                   8. Kondensor

                                   9. Oven

                                   10. Hotplate

                                   11. Pompa vakum

                                   12. Desikator

Bahan                   :     1. H₂SO₄ 1,25 %

                                   2. NaOH 3,25 %

                                   3. kertas saring Whatman

                                   4. Aquadest

                                   5. Etanol 96 %

Cara Kerja            :

1.      Timbang dengan seksama 2-4 gram cuplikan, bebaskan lemaknya dengan cara ekstraksi dengan cara soxlet atau dengan cara mengaduk,mengenaptuangkan contoh dalam pelarut organic sebanyak 3 kali. Keringkan contoh dan masukkan ke dalam Erlenmeyer 500 mL.

2.      Tambahkan 50 mL larutan H₂SO₄ 1,25 %, kemudian didihkan selama 30 menit dengan menggunakan pendingin tegak.

3.      Tambahkan 50 mL NaOH 3,25 % dan didihkan lagi selama 30 menit

4.      Dalam keadaan panas saring dengan corong Buchner yang berisi kertas saring tak berabu Whatman 54, 41, atau 541 yang telah dikeringkan dan diketahui bobotnya.

5.      Cuci endapan yang terdapat pada kertas saring berturut-turut dengan H2SO4 1,25 % panas, air panas dan etanol 96 %

6.      Angkat kertas saring beserta isinya, masukkan kedalam kotak timbang yang telah diketahui bobotnya, keringkan pada suhu 105°C dinginkan dan timbang sampai bobot tetap.

7.      Bila ternyata serat kasar lebih besar 1 % , abukan kertas saring beserta isinya, timbang sampai bobot tetap.

Berat residu     =  berat serat kasar

                              Wi  -  Wo

% Serat kasar  =                       X 100 %

                                          Ws

Wo  :  berat kertas saring

Wi   :  berat kertas saring + residu setelah dikeringkan

Ws  :  berat contoh

Table pengamatan

Kode	Wo	Ws	Wi	% protein	Rata-rata

3        ANALISIS KADAR LEMAK

Lemak dan minyak merupakan salh satu kelompok yang ternasuk golongan lipida.sifat yang khas dan mencirikan golongan lipida adalah daya larutnya dalam pelarut organic (ether,benzene,kloroform)atau sebaliknya ketidaklarutannya dalam pelarut air.

Analisa lemak dan minyak lebih mudah dianalisa karena molekul lemak dan lemak relative lebih kecil dan kurang kompleks dibandingkan dengan molekul karbohidrat dan protein.

Analisa lemak dan minyak umum yang dilakukan pada bahan makanan digolongkan dalam 3 kelompok tujuan :

1.      Penentuan kadar lemak atau minyak yang terdapat pada bahan makanan atau pertanian.

2.      Penentuan kualitas minyak murni sebagai bahan makanan yang berkaitan dengan proses ekstraksinya atau ada tidaknya pemurnian lanjutan seperti penjernihan (refining), penghilangan bau (deodorizing), penghilangan warna (bleaching) dan lain-lain.

3.      Penentuan sifat fisis atau kimia khas yang mencirikan sifat minyak tertentu.

Ekstraksi merupakan salah satu cara untuk menentukan kadar lemak dalam suatu bahan. Sebagai senyawa hidrokarbon lemak dan minyak pada umumnya tidak larut dalam air tetapi larut dalam pelarut organic.pelarut yang umum digunakan untuk ekstraksi lemak adalah  heksan, ether dan klroroform

Berikut ini contoh beberapa jenis bahan pelarut yang sesuai untuk ekstraksi lemak yaitu :

a.       Senyawa trigliserida yang bersifat nonpolar akan mudah diekstraksi dengan pelarut nonpolar misalnya heksan atau petroleum eter.

b.      Glikolipida yang polar akan mudah diekstraksi dengan alcohol yang polar.

c.       Lesitin akan mudah larut dalam pelarut yang sedikit asam misalnya alcohol.

d.      Fospolipida yang bersifat polar dan asam akan mudah larut dalam kloroform yang sedikit polar dan basa. Senyawa ini tidak larut dalam alcohol.

Petoleum ether atau heksan adalah  bahan pelarut lemak nonpolar yang paling banyak digunakan karena harganya relative murah, kurang berbahaya terhadap kebakaran dan ledakan serta lebih selektif untuk lemak nonpolar.

Ada 2  cara penentuan kadar lemak berdasarkan jenis bahan yang akan ditentukan :

1.      Bahan Kering

Untuk penentuan lemak dari bahan kering, bahan dibungkus atau ditempatkan dalam thimble lalu dikeringkan dalam oven untuk menghilangkan airnya. Pemanasan dilakukan secepatnya dan dihindari suhu yang terlalu tinggi. Ekstraksi lemak dari bahan kering dapat dilakukan secara terputus-putus atau berkesinambungan. Ekstraksi secara terputus dilakukan dengan soklet atau alat ekstraksi ASTM (American society testing material ). Sedangkan secara berkesinambungan dengan alat goldfisch atau ASTM yang telah dimodifikasi.

2.      Bahan Cair

Penentuan lemak dari bahan cair dapat menggunakan botol Babcock atau dengan Mojonnier

LEMBAR KERJA III

I.                   Analisis Lemak dengan Metode Ekstraksi Langsung

Prinsip       :     Ekstraksi lemak bebas dengan pelarut non polar

Alat            :     1.  Kertas saring

                        2.  Labu lemak

                        3.  Alat soxlet

                        4.  Pemanas listrik

                        5.  Oven

                        6.  Neraca analitk

                        7.  Kapas bebas lemak

                        8.  Kaca arloji

                        9.  Krustang

Bahan        :     n-Heksana (C₆H₁₄)

Cara Kerja :

1.      Timbang dengan seksama 1-2 gram sampel masukkan kedalam selongsong kertas yang dilapisi kapas

2.      Sumbat selongsong kertas berisi contoh tersebut dengan kapas

3.      Keringkan pada oven pada suhu 80°C selama kurang lebih 1 jam, kemudian masukkan kedalam alat soxlet yang dihubungkan dengan labu lemak yang telah dikeringkan dan diketahui bobotnya.(timbang labu sebelum dipakai)

4.      Ekstrak dengan heksana atau pelarut lemak lainnya selama lebih kurang 6 jam

5.      Suling heksana (1 ½ kali dari isi tabung soxlet) dan keringkan ekstrak lemak dalam oven pengering pada suhu 105 °C

6.      Dinginkan dalam desikator dan timbang

7.      Ulangi hingga tercapai berat konstan.

Table data

NO	Wo	Ws	Wi	% lemak	Rata-rata

Perhitungan  :

                               Wi – Wo

Kadar lemak  =                           X 100 %

                                     Ws

Ws    =  bobot contoh (gram) (sebelum dikeringkan )

Wi     =  bobot labu + lemak setelah diekstraksi (gram )

Wo    =  bobot labu lemak sebelum ekstraksi (gram)

II.                Analisa Lemak dengan Metode Weibull

Prinsip       :       Ekstraksi lemak dengan pelarut non polar setelah contoh dihidrolisis dalam suasana

                          Asam untuk membebaskan lemak yang terikat

Alat            :       1.  Kertas saring

                          2.  Labu lemak

                          3.  Alat soxlet

                          4.  Pemanas listrik

                          5.  Oven

                          6.  Neraca analitik

                          7.  Kapas bebas lemak

                          8.  Gelas piala

Bahan        :       1.  n-heksana

                          2.  HCl 25%

Cara Kerja :

1.      Timbang dengan seksama 1-2 gram contoh kedalam gelass piala.

2.      Tambahkan 30 mL HCl 25%dan 20 mL air serta beberapa batu didih.

3.      Tutup gelas piala dengan kaca arloji dan didihkan selama 15 menit.

4.      Saring dalam keadaan panas dan cuci dengan air panas hingga tidak bereaksi asam lagi,cek dengan lakmus,bila asam kertas saring berwarna hitam, maka terus tambah air panas.

5.      Keringkan kertas saring beserta isinya  pada suhu 100-105°C.

6.      Masukkan kedalam selongsong kertas yang dialasi kapas.

7.      Masukkan kedalam alat soxlet yang dihubungkan dengan labu lemak yang telah dikeringkan dan diketahui bobotnya.

8.      Ekstrak dengan heksana atau pelarut lemak dalam oven pengering pada suhu 105°C

9.      Dinginkan dalam eksikator dan timbang

10.  Ulangi hingga tercapai konstan

Table Data

NO	Wo	Ws	Wi	% lemak	Rata-rata

Perhitungan    :

                              Wi – Wo

Kadar lemak   =                         X 100%

                                    Ws

Ws     =  Bobot contoh (gram)

Wi     =  Bobot labu + lemak setelah ekstraksi (gram)

Wo    =  Bobot labu lemak sebelum ekstraksi (gram)

4.      ANALISIS KADAR ABU

Abu adalah zat organic sisa hasil pembakaran suatu bahan organic. Kandungan abu dan komposisinya tergantung pada macam bahan dan cara pengabuannya. Beberapa sampel kadar abu dalam bebrapa bahan dapat dilihat pada table berikut :

NO	BAHAN	ABU (%)
1.	Susu	0,5 – 1,0
2.	Susu kering tidak berlemak	1,5
3.	Buah-buahan segar	0,2 – 0,8
4.	Buah-buahan yang dikeringkan	3,5
5.	Biji kacang-kacangan	1,5 – 2,5
6.	Daging segar	1
7.	Daging yang dikeringkan	12
8.	Daging ikan segar	1 - 2
9.	Sayur -sayuran	1

Kadar abu berhubungan erat dengan mineral suatu bahan. Mineral dalam suatu bahan ada ada dua macam garam yaiti garam organic dan garam anorganik. Garam organic seperti garam-garam asam malat, oksalat, asetat, pektat. Sedangkan garam anorganik yaitu garam fosfat, karbonat, klorida, sulfat dan nitrat.

Komponen mineral suatu bahan sangat bervariasi baik macam dan jumlahnya. Sebagi gambaran dapat dikemukakan beberapa sampel sebagai berikut :

a.      Kalsium (CA)

Kalsium relative tinggi pada susu dan hasil olahannya, serellia,kacang-kacangan, telur, ikan, dan buah-buahan. Sebaliknya bahan yang kandungan kalsiumnya sedikit adalh gula, pati dan minyak.

b.      Fosfor (P)

Bahan yang paling banyak mengandung fosfor adalah susu dan olahannya, daging, ikan, daging unggas, telur dan kacang-kacangan.

c.       Besi (Fe)

Bahan yang kaya mineral besi adalah tepung gandum, daging unggas, ikan, seafood, telur. Sedangkan makanan yang mengandung besi adalah susu dan olahannya, buah-buahan dan sayur-sayuran.

d.      Natrium (Na)

Bahan yang banyak mengandung natrium adalah garam yang banyak digunakan sebagai ingredient (bumbu), salted food.

e.       Kalium (K)

Bahan yang banyak mengandung mineral kalium ialah susu dan hasil olahannya, buah-buahan, serelia, daging, ikan, unggas, telur, dan sayur-sayuran.

f.        Magnesium (Mg)

Bahan yang mengandung Magnesium adalah kacang-kacangan, serelia, sayuran, buah-buahan dan daging.

g.      Belerang (S)

Belerang banyak terdapat dalam bahan yang kaya akan protein seperti susu, daging, kacang-kacangan, telur.

h.      Kobalt (Co)

Bahan yang kaya mineral kobalt adalah sayur-sayuran dan buah-buahan.

i.        Seng (Zn)

Bahan makanan hasil laut (seafood), merupakan bahan yang banyak mengandung unsure seng.

a.      Analisis kadar Abu

Penentuan konsitituen mineral adalah bahan hasil pertanian dibedakan menjadi dua tahapan yaitu :

1.      Penentuan abu (total larut dan tidak larut)

2.      Penentuan individu komponen

1.      Penentuan Kadar Abu Secara Langsung (cara kering)

Penentuan kadar abu secara langsung (cara kering) adalah dengan mengoksidasikan semua zat organic pada suhu yang tinggi, yaitu sekitar 500 – 600 °C dan kemudian melakukan penimbangan zat yang tertinggal setelah proses pembakaran tersebut. Sampel yang akan diabukan ditimbang sejumlah tertentu tergantung macam bahannya. Beberapa sampel bahan dan jumlah berat yang diperlukan dapat dilihat pada table berikut :

Bahan	Berat Bahan (gr)
Ikan dan hasil olahannya,biji-bijian dan makanan ternak	2
Padi-padian, susu, dan keju	3 - 5
Gula, daging dan sayuran	5 - 10
Jelly, sirup, jam dan buah kering	10
Juice, buah segar, buah kalengan	25
anggur	50

2.      Penentuan Kadar Abu Secara Tidak Langsung (cara basah)

Pengabuan basah terutama digunakan untuk digesti sampel dalam usaha penentuan elemen runut (trace elemen) dan logam-logam beracun. berbagai  cara yang ditempuh untuk memperbaiki cara kering yang biasanya memerlukan waktu yang lama serta adanya kehilangan karena pemakaian suhu tinggi yaitu antara lain dengan pengabuan cara basah. Pengabuan cara basah ini prinsipnya adalah memberikan pereaksi kimia tertentu kedalam bahan sebelum dilakukan pengabuan.

Berbagai bahan kimia yang sering digunakan untuk pengabuan basah ini dapat disebutkan sebagai berikut :

a.       Asam sulfat dapat membantu mempercepat terjadinya reaksi oksidasi.

b.      Campuran asam sulfat dan kalium sulfat dapat digunakan untuk mempercepatb dekomposisi sampel. Kalium sulfat dapat menaikkan titik didih asam sulfat sehingga suhu pengabuan menjadi tinggi dan proses pengabuan dapat dipercepat.

c.       Campuran asam sulfat dan asam nitrat dapat mempercepat pengabuan, kedua asam merupakan oksidator kuat yang dapat menurunkan suhu digesti bahan pada kisaran 350°Csehingga komponen yang menguap dan terdekomposisi pada suhu tinggi dapat dipertahankan dalam abu.

d.      Asam perklorat dan asam nitrat dapat digunakan untuk bahan yang sangat sulit mengalami oksidasi. Penambahan perklorat sebagi oksidator dapat mempercepat pengabuan, namun perklorat sebagai bahan yang bersifat explosive cukup berbahaya. Penambahan asam nitrat dan perklorat membutuhkan waktu relative singkat untuk pengabuan yaitu 10 menit.

Sebagaimana cara kering, setelah pengabuan selesai, bahan diambil dari muffle (tanur) lalu dimasukkan dalam oven bersuhu 105°C sekitar 15 – 30 menit selanjutnya masukkan kedalam eksikator sampai dingin kemudian dilakukan penimbangan. Apengabuan diulangi lagi sampai diperoleh berat abu yang konstan. Perbedaan pengabuan cara kering dan basah

·         Cara kering digunakan untuk penentuan total abu dalam suatu bahan makanan dan hasil pertanian, sedangkan cara basah untuk elemen runut (trace elemen)

·         Cara kering untuk penentuan abu yang larut dan tidak larut dalam air serta abu yang tidak larut dalam air serta abu yang tidak larut dalam asam memerlukan waktu yang relative lama sedangkan cara basah memerlukan waktu yang cepat.

·         Cara kering memerlukan waktu yang relative tinggi, sedangkan cara basah dengan suhu relative rendah.

·         Cara kering digunakan untuk sampel yang relative banyak, sedangkan cara basah sebaiknya untuk sampel yang sedikitdan memerlukan pereaksi yang agak berbahaya.

                                                                        

LEMBAR KERJA IV

A.     PENENTUAN KADAR ABU TOTAL

Metode                 :     SNI 01 – 2891 – 1992 butir 6.1. Cara uji makanan dan minuman

Prinsip                  :     Pada proses pengabuan zat-zat organic diuraikan menjadi air dan

                                   CO₂ tetapi bahan organic tidak

Alat                      :     1. Neraca Analitik

                                   2. Cawan porselen

                                   3. Spatula

                                   4. Kawat kasa

                                   5. Kaki tiga

                                   6. Lampu spiritus

                                   7. Krustang

                                   8. Muffle/tanur

                                   9. Eksikator

Bahan                   :     1. Sampel

Langkah Kerja

Ø  Timbang  dengan seksama 2 -3 gram sampel kedalam sebuah cawan porselen atau (platina) yang telah diketahui bobotnya. Untuk sampel cairan, uapkan terlebih dahulu diatas penangas air sampai kering.

Ø  Arangkan diatas nyala pembakar, lalu abukan dalam tanur listrikpada suhu maksimum 550°C sampai pengabuan sempurna (sekali-kali pintu tanur dibuka sedikit,agar oksigen bisa masuk)

Ø  Dinginkan dalam eksikator,lalu timbang sampai bobot tetap

Perhitngan

                         W1 – W2

% Abu     =                                        X 100 %

                                           W

       W      =  bobot sampel sebelum diabukan (gram)

       W1    =  bobot sampel + cawan sesudah diabukan (gram)

       W2    =  bobot cawan kosong

Table Pengamatan

Kode	W	W1	W2	% abu	Rata-rata

B.     PENENTUAN KADAR ABU SULFAT

Metode            :       SNI  01- 2891 – 1992 butir 6.2 cara uji makanan dan minuman

Prinsip             :       Pengukuran abu yang diendapkan sebagai sulfat

Alat                  :       1. Neraca analitik

                                2. Cawan porselen

                                3. Spatula

                                4. Kawat kasa

                                5. Kaki tiga

                                6. Lampu spiritus

                                7. Krustang

                                8. Muffle/tanur

                                9. Eksikator

                                10. Pipet tetes

Bahan              :       1. Sampel

                                2. H₂SO₄ pekat

Langkah Kerja

Ø  Larutkan abu bekas penentuan kadar abu dengan penambahan 25 mL HCl 10 %

Ø  Didihkan selama 5 menit

Ø  Saring larutan dengan menggunakan kertas saring bebas abu dan cuci dengan aquadest sampai

        Bebas klorida

Ø  Keringkan kertas saring dalam oven

Ø  Masukkan kedalam cawan porselen (platina) yang telah diketahui bobotnya dan abukan.

Ø  Dinginkan dalam eksikator,lalu timbang sampai bobot tetap

Perhitungan   :

                      W₁- W₂

% Abu    =                             X 100 %

                           W

W    =  bobot sampel sebelum diabukan (gram)

W₁   =  bobot sampel + cawan sesudah diabukan (gram)

W₂   =  bobot cawan kosong (gram)

          Table Pengamatan

Kode	W	W1	W2	% Abu	Rata-rata

5.      ANALISIS KADAR PROTEIN

            Protein dalam bahan biologi biasanya terdapat dalam bentuk ikatan fisis yang renggang atau dengan ikatan kimia yang lebih erat dengan karbohidrat atau lemak. Dengan adanya pemanasan protein dalam bahan makanan akan mengalami perubahan dan membentuk persenyawaan dengan bahan lain. Pemanasan atau perlakuan yang lebih dapat merusak protein sehingga mengubah nilai gizi. Analisa protein bertujuan menera jumlah kandungan protein dalam bahan makanan secara empiris (tidak langsung) yaitu melalui kandungan N yang ada dalam bahan, serta penentuan secara absolut (langsung) dengan pemisahan,pemurnian atau penimbangan protein. Namun penentuan secara langsung sangat sukar serta membutuhkan waktu yang lama,ketrampilan tinggi dan biaya yang mahal namun dapat memberikan hasil yang lebih tepat.

            Penentuan jumlah protein secara empiris yang umum dilakukan adalah dengan menentukan jumlah Nitrogen (N) yang dikandung bahan makanan,cara ini dikembangkan oleh Kjeldahl ilmuwan Denmark tahun 1883.

            Dalam penentuan protein,seharusnya hanya nitrogen yang berasal dari protein saja yang ditentukan.  Tetapi secara teknis sulit dilakukan karena jumlah kandungan senyawa lain selain protein dalam bahan biasanya sangat sedikit,sehinggapenentuan jumlah N total tetap dilakukan untuk mewakili jumlah protein yang ada.  Penentuan secara Kjeldahl ini sering disebut kadar protein kasar (crude protein).

            Dasar perhitungan protein menurut Kjedahladalah hasil penelitian dan pengamatanyang menyatakan bahwa umumnya protein alamiah mengandung unsure N rata-rata 16 % (dalam protein murni). Apabila jumlah unsure N diketahui dengan berbagai cara maka jumlah protein dapat diperhitungkan dengan

Jumlah N x 100/16 atau Jumlah N x 6,25

 

Untuk campuran senyawa-senyawa protein yang belum diketahui komposisi unsure penyusunnya secara pasti, maka factor perkalian 6,25 inilah yang dipakai. Sedangkan untuk protein tertentu yang telah diketahui komposisinya dengan tepat maka perkalian factor yang lebih tepat yang dipakai . contoh

·         5,70 untuk protein gandum

·         6,38 untuk protein susu

·         5,55 untuk gelatin (protein terlarut)

Penentuan protein berdasarkan jumlah N menunjukkan protein kasar karena selain protein juga terikut senyawa N yang bukan protein misalnya urea, nitrit, asam amino, amida, purin dan pirimidin.

            Analisa protein cara Kjeldahl dibagi menjadi 3  tahap yaitu Destruksi, Destilasi, dan Titrasi  :

v  Sampel didestruksi dengan adanya asam kuat dengan bantuan katalis yang akan mengubah nitrogen amin menjadi ion ammonium.

v  Ion ammonium diubah menjadi gas ammonium yang selanjutnya dipanaskan dan didestilasi.Gas ammonium yang telah ditampung dalam larutan penampung yang larut kembali menjadi ion ammonium.

v  Sejumlah ammonia yang telah ditampung ditentuka melalui titrasi dengan larutan baku dan selanjutnya dibuat perhitungan

1.      Tahap Destruksi

Sampel dipanaskan dalam asam sulfat pekat sehingga terjadi destruksi menjadi unsure-unsurnya. Elemen karbon dan hydrogen teroksidasi menjadi CO, CO₂, dan HgO.  sedangkan nitrogen (N) dalam sampel akan diubah menjadi (NH₄)₂SO_4. Untuk mendestruksi 1 gram protein diperlukan 9 gram asam sulfat, sedangkan untuk 1 gram lemak diperlukan 17,8 gram asam sulfat. Untuk mempercepat proses destruksi sering ditambahkan katalisator berupa campuran Na₂SO₄ dan H₂O (20 :1). Gunning  menganjurkan penggunaan K₂SO4 atau CuSO₄  dapat mempercepat proses destruksi. Tiap 1 gram K2SO4 dapat menaikkan titik didih  3°C. suhu destruksi 370 - 410°.

2.      Tahaap Destilasi

Dalam tahap destilasi , ammonium sulfat yang larut dalam air diubah menjadi ammonia (NH3)yang berbentuk gas dengan penambahan NaOH sampai alkalis (pH dinaikkan) dan dipanaskan.

Asam standar yang dapat dipakai adalah asam klorida atau asam borat 4 % dalam jumlah yang berlebihan.

·            Apabila asam klorida sebagai penangkap ammonia maka reaksi yang terjadi selama destilasi adalah sebagai berikut

NH₃  +  HCl                              NH₄Cl

·            Apabila asam borat sebagai penangkap ammonia maka reaksi yang terjadi selama destilasi adalah sebagai berikut :

NH3  +  HBO₂                          NH₄BO₂

3.      Tahap Titrasi

·         Apabila penampung destilat digunakan asam klorida  maka sisa asam klorida yang tidak bereaksi dengan ammonia dititrasi dengan NaOH standar (0,1). Akhir titrasi ditandai dengan tepat perubahan warna larutan menjadi merah muda dan tidak hilang selama 30 detik bila menggunakan indicator fenolftalein. Selisih jumlah titrasi blanko dan sampel merupakan jumlah ekivalen nitrogen.

            HCl  +  NaOH                  NaCl  +  H₂O

                        mL NaOH (blanko – sampel)

         % N   =                                                          x   N. NaOH x  14,008 x 100%

                          Berat sampel (g) x 1000

·         Apabila penampung destilasi digunakan asam borat maka banyaknya asam borat yang bereaksi dengan ammonia dapat diketahui dengan titrasi menggunakan asam klorida 0,1 N dengan indicator campuran (brom kresol hijau dan metal merah). Akhir dari titrasi ditandai dengan perubahan warna biru menjadi merah muda. Selisih jumlah titrasi sampel dan blanko merupakan jumlah ekivalen nitrogen.

                  NH₄BO₂  +   HCl                      NH₄Cl  +  HBO₂

                                        mL HCl  ( sampel – blanko)     

%N   =                                                     x N. HCl x 14.008 x 100%

    Berat sampel (g) x 1000

Setelah diperoleh %N selanjutnya dihitung kadar proteinnya dengan mengalikan suatu factor. Besa     r perkalian N menjadi protein tergantung pada persentase N yang menyusun proteindalam suatu bahan. Besarnya factor perkalian untuk beberapa bahan disajikan dalam table berikut :

Tabel factor konversi N beberapa bahan pangan

Bahan	Faktor Konversi
Bir, sirup, biji-bijian, ragi	6,25
Buah-buahan, the, anggur,malt	6,25
Makanan ternak	6,25
beras	5,95
Roti,gandum,macaroni,mie	5,70
Kacang tanah	5,46
kedele	5,75
kenari	5,18
susu	6,38
gelatin	5,55

LEMBAR KERJA V

PENENTUAN N TOTAL DENGAN METODE SEMIMIKRO KJELDAHL

Metode                        :        Semimikro Kjeldahl. SNI 01- 2891- 1992 butir 7 Cara uji makanan dan

                                    Minuman

Prinsip                 :       Senyawa Nitrogen diubah menjadi ammonium sulfat oleh H2SO4 pekat

                                    Amonium su;fat yang terbentuk diuraikan dengan NaOH. Amoniak yang

Dibebaskan diikat dengan asam borat kemudian dititer dengan larutan baku

                                    Asam.

Alat                      :       1.  Neraca Analitik

                                    2.  Spatula

                                    3.  Labu Kjeldahl

                                    4,  Digestor

                                    5.  Labu ukur 100 mL

                                    6.  Corong saring

                                    7.  Pipet tetes

                                    8.  Pipet volum 5 mL

                                    9.  Erlenmeyer

                                    10.Alat Destilasi

                                    11. Buret

                                    12. Pipet ukur 25 mL

                                    13. pipet ukur 10 mL

Bahan                   :       1.  Selenium campuran

                                    2.  asam sulfat pekat

                                    3.  Brom kresol hijau

                                    4.  Metil merah

                                    5.  Indikator fenolftalein

                                    6.  NaOH 30 %

                                    7.  Asam Borat 2 %

                                    8.  HCl 0,01 N

                                    9.  Aquadest

Langkah Kerja

1.      Timbang  dengan seksama 0,51 gram sampel, masukkan kedalam labu kjeldahl 100 mL

2.      Tambahkan 2 gram campuran selenium dan 25 mL H₂SO₄ pekat

3.      Panaskan diatas penangas listrik atau api pembakar sampai mendidih dan larutan menjadi jernih kehijauan ( ± 2 jam )

4.      Biarkan dingin, kemudian encerkan dan masukkan kedalam labu ukur 100 mL. tera sampai batas

5.      Pipet 5 mL larutan dan masukkan kedalam alat penyulingan, tambahkan 5 mL NaOH 30 % dan beberapa tetes indicator fenolftalein.

6.      Suling selam lebih kurang 10 menit, sebagai penampung gunakan 10 mL asam borat 2 % yang telah dicampur indicator campuran.

7.      Bilas ujung pendingin dengan aquadest

8.      Titer dengan HCl 0,01 N

9.      Kerjakan penetapan Blanko

Perhitungan  :   

                                   ( V₁ – V₂)  x   N HCl  x   0,014  x  fk  x  fp x  100    

Kadar Protein       = 

                                                                        W

V1                      =    volume titrasi sampel

V2                =    volume titrasi blanko

N HCl           =    volume HCl yang telah distandarisai

fk                  =    factor konversi

fp                  =    factor pengenceran

W                  =    berat sampel

     Table Pengamatan

Kode	W	V1	V2	N HCl	fk	fp	% Protein	Rata-rata

LEMBAR KERJA VI

Penentuan N Total dengan Metode Gunning

Metode         :     Gunning

Prinsip          :     Senyawa Nitrogen diubah menjadi Amonium Sulfat oleh H₂SO₄ pekat.

                           Ammonium sulfat yang terbentuk diuraikan dengan NaOH. Amoniak yang

      Dibebaskan diikat dengan asam klorida dan kemudian dititer dengan larutan baku

                           NaOH.

Alat               :     1.  Neraca analitik

                           2.  SpatulaS

                           3.  Labu Kjeldahl

                           4.  Digestor

                           5.  Pipet tetes

                           6.  Pipet Volume 5 mL

                           7.  Erlenmeyer

                           8.  Alat destilasi

                           9.  Buret

                         10.  Pipet Ukur 25 mL

                         11.  Pipet ukur 10 mL

Bahan           :     1.  K₂S

                           2.  Na₂SO₄ anhidrat

                           3.  Asam sulfat pekat

                           4.  CuSO₄

                                  5.  Fenolftalein

                           6.  NaOH 45 %

                           7.  Zn

                           8.  NaOH 0,1 N

                           9.  HCl 0,1 N

                        10.  Aquadest

Langkah Kerja

Ø  Timbang 0,7 – 3,5 gram cuplikan, masukkan kedalam labu Kjeldahl 100 mL.

Ø  Tambahkan 10 gram K₂S atau Na₂SO₄ anhidrat dan 15 – 25 mL H₂SO₄ pekat.  Bila destruksi sukar dilakukan tambahkan 0,1 – 0,3 gram CuSO₄ dan digojok.

Ø  Panaskan diatas penangas listrik atau api pembakar mula-mula dengan api kecil dan setelah asap hilang, api dibesarkan sampai mendidih dan larutan menjadi jernih kehijauan (± 2 jam)

Ø  Biarkan dingin , kemudian encerkan dan tambahkan 200 mL aquadest dan 1 gram Zn serta larutan NaOH 45 % sampai cairan bersifat basa.

Ø  Destilasi sampai semua amoniak menguap.  Destilat ditampung dalam Erlenmeyer yang berisi 100 mL HCl 0,1 N yang telah diberi beberapa tetes indicator fenolftalein 1 %.  Destialsi berakhir setelah volume mencapai 150 mL atau tidak lagi bersifat basa.

Ø  Kelebihan HCl 0,1 N dalam destilat dititrasi dengan larutan baku NaOH 0,1 N.

Ø  Kerjakan penetapan Blanko.

Perhitungan       :

                                  (V₂ – V₁)  x  N NaOH  x  14,008  x  fk

Kadar Protein    =                                                                           x  100

                                                            W  x  10

V₁                               =   Volume titrasi sampel

V₂                               =   Volume titrasi blanko

N NaOH             =   Normalitas NaOH yang telah distandarisasi

Fk                       =   factor konversi

W                       =   berat sampel

Table Pengamatan

kode	W	V1	V2	N NaOH	fk	% Protein	Rata-rata

6.      ANALISIS KADAR KARBOHIDRAT

A.         KARBOHIDRAT

         Karbohidrat adalah polihidroksialdehid atau polihidroksiketon.  Nama karbohidrat digunakan pada senyawa-senyawa dengan rumus empiris CnH2nOn yaitu karbon yang mengalami hidratasi.

Dialam karbohidrat merupakan hasil sintesis dari CO2 dan H2O dengan bantuan sinar matahari dan hijau daun (klorofil).  Hasil fotosintesa ini kemudian mengalami polomerisasi menjadi pati dan senyawa-senyawa bermolekul besar lain yang menjadi cadangan makanan pada tanaman.

         Secara alami ada tiga bentuk karbohidrat penting yaitu ;

1.      Monosakarida

2.      Oligosakarida

3.      Polisakarida

   Monosakarida merupakan karbohidrat yang paling sederhana. Monosakarida sedikit dijumpai dialam karena tidak digunakan sebagai cadangan makanan seperti polisakarida. Monosakarida untuk makanan dan obat-obatan seperti glukosa dan fruktosa sering dibuat dari jagung , ketela  dan lain-lain.

   Bentuk umum oligosakarida adalah disakarida yang terjadi dari proses kodensasi dua molekul monosakarida,contoh adalah sukrosa. Mono dan disakarida memiliki rasa manis. Oleh karena itu disebut sugar atau gula. Glukosa (gula anggur) dan fruktosa (gula buah) merupakan contoh monosakarida  yang banyak dijumpai dialam. Contoh –contoh dari disakarida antara lain sukrosa (gula tebu,bit) dan laktosa (gula susu).

   Polisakarida merupakan kelompok karbohidrat yang paling banyak dijumpai dialam  yang terbentuk dari ratusan bahkan ribuan unit monosakarida.  Sebagian polisakarida membentuk struktur tanaman yang tidak larut misalnya selulosa dan hemiselulosa.  Sebagian lagi membentuk senyawa cadangan berbentuk pati dalam tanaman atau glikogen pada sel-sel hewan.

B.     Analisa Karbohidrat

Ada berbagai cara untuk menentukan banyaknya karbohidrat dalam suatu bahan  antara lain dengan

·         Cara kimia

·         Cara fisik

·         Cara enzimatik (biokimia)

·         Cara kromatografi

Berbagai cara diatas dilakukan untuk mengetahui jumlah kuantitatif dalam rangka menentukan komposisi suatu bahan makanan, penentuan sifat fisis, atau kimiawinya yang berkaitan dengan kekentalan, kelekatan, stabilitas larutan dan tekstur hasil olahannya.

Penentuan karbohidrat yang paling mudah adalah dengan cara perhitungan kasar (proximat analysis) atau disebut juga Carbohydrate by Difference.  Yang dimaksud dengan proximate analysis adalah suatu analisis dimana kandungan karbohidrat termasuk serat kasar diketahui bukan melalui analisis tetapi melalui perhitungan sebagai berikut :

% karbohidrat   =   100% - % (protein + lemak + abu + air)

Perhitungan Carbohydrate by Difference adalah penentuan karbohidrat dalam makanan secara kasar, hasilnya biasanya dicantumkan dalam daftar komposisi bahan makanan.

C.     Uji Kuantitatif Karbohidrat

   Penentuan karbohidrat yang termasuk polisakarida maupun oligosakarida memerlukan perlakuan pendahuluan yaitu hidrolisa terlebih dahulu sehingga diperoleh monosakarida.  Untuk keperluan ini maka bahan dihidrolisa dengan asam atau enzim pada suatu keadaan tertentu. Penetuan monosakarida yang dihasilkan dapat ditentukan dengan cara sebagai berikut :

1.      Cara Kimiawi

a.      Metode oksidasi dengan Cupri

Metode ini berdasarkan reduksi cupri oksida menjadi kupro oksida dengan adanya gula reduksi.  Pereaksi metode ini terdiri atas campuran kupri sulfat, Na-karbonat dan asam sitrat (pereaksi Luff) atau campuran cupri sulfat danapan kupri oksid K-Na-tartrat (pereaksi soxhlet) K-Na-tartrat berfungsi mencegahpengendapan cupri oksida dalam larutan pereaksi.  Kupri sulfat berfungsi sebagai oksidator. Kupri sulfat dengan gula reduksi akan mengalami reduksi yang menghasilkan endapan berwarna merah bata. Jumlah endapan kupro oksida ekivale dengan banyaknya jumlah gula reduksi dalam sampel.kupro oksida yang terbentuk dapat diketahui dengan cara peninbangan setelah pengeringan atau melarutkan kembali kupro oksida dan selanjutnya dititrasi. Penentuan gula reduksi dalam larutan yang sering dilakukan adalah sebagai berikut :

1.      Cara Luff Schoorl

2.      Cara Munson Walker

3.      Cara Lane-Eynon

b.      Metode Oksidasi dengan larutan ferisiannida alkalis

c.       Metode Iodometri

2. Cara Enzimatis

a.      Cara Kromatografi

3. Cara Fisis

1.      Cara Luff Schoorl

Penentuan gula dengan cara Luff Schoorl yang ditentukan bukan kuprooksida yang mengendap tetapi dengan menentukan kuprioksida dalam larutan sebelum sebelum direaksikan dengan gula reduksi (titrasi blanko) dan sesudah direaksikan dengan sampel gula reduksi (titrasi sampel). Titrasi menggunakan Na-tiosulfat. Selisih titrasi blanko dengan titrasi sampel ekiuvalen dengan kuprioksida yang terbentuk dan juga ekuivalen dengan jumlah gula reduksi yang ada dalam bahan atau larutan.

2.      Cara Munson Walker

Menentukan banyaknya kuprioksida yang terbentuk dengan penimbangan atau melarutkan kembali dengan asam nitrat lalu mentitrasinya dengan tiosulfat. Jumlah  kuprioksida yang terbentuk ekuivalen dengan gula reduksi dalam larutan.

3.      Cara Lane-Eynon

Penetuan gula dengan menitrasi pereaksi Soxhlet (larutan CuSO₄, K-Na-tartrat) dengan gula yang akan dianalisis. Banyaknya larutan sampel yang dibutuhkan untuk menitrasi pereaksi soxhlet menunjukkan banyaknya gula dalam sampel dengan melihat table Lane-Eynon.

LEMBAR KERJA VII

1.      Metode :                Luff Schoorl

2.      Prinsip  :                Hidrolisis Karbohidrat menjadi monosakarida yang dapat mereduksi                         Cu²⁺ menjadi Cu⁺ Kelebihan Cu²⁺ dapat dititer secara iodometri.

3.      Alat dan Bahan

Alat      :

·      Neraca analitik

·      Erlenmeyer 500 mL, 250 mL

·      Pendingin tegak

·      Labu ukur

·      Corong

·      Buret

·      Hot plate

·      Pipet gondok 10 mL, 25 mL

·      Gelas ukur

·      Pipet tetes

·      Kertas saring

Bahan

·      HCl 3 %

·      NaOH 30 %

·      CH₃COOH 3 %

·      KIO₃

·      Kertas lakmus

·      Larutan KI 20%

·      Larutan H₂SO₄ 25%

·      Larutan H₂SO₄ 4N

·      Larutan tiosulfat 0,1 N

·      Indicator kanji / amilum 0,5 %

·      Table Luff Schroorl

4.      Pembuatan Larutan

a.      Pereaksi Luff Schoorl

Larutkan 143,8 gr Na₂CO₃ anhidrat dalam 300 mL air suling. Sambil diaduk tambahkan 50 gr asam sitrat yang telah dilarutkan dengan 50 mL air suling. Tambahkan 25 gr CuSO45H2O yang telah dilarutkan dengan 100 mL air suling. Pindahkan larutan tersebut kedalam labu ukur 1 liter, tepatkan sampai tanda batas dengan air suling dan kocok. biarkan semalam dan saring bila perlu. Larutan Luff Schoorl harus mempunyai pH 9,3 – 9,4.

b.      Larutan KI 20%

Timbang 20 gr KI dengan air suling sampai 100 mL.

c.       Larutan amilum 0,5%

Timbang 0,5 gr amilum, larutkan dengan air suling panas sampai 100 mL.

5.      Pembakuan larutan tiosulfat 0,1 N

Timbang 0,1 gr KIO₃ kedalam  larutkan dengan 25 mL air suling. Tambahkan 5 mL larutan KI 20% dan 5 mL H₂SO₄ 2N. titrasi cepat dengan larutan tiosulfat 0,1 N sampai larutan berwarna kuning.  Tambahkan 5 mL amilum 0,5% lanjutkan titrasi sampai larutan biru menjadi tidak berwarna.

6.      Penentuan Karbohidrat

a.       Timbang dengan seksama lebih kurang 5 gr cuplikan kedalam Erlenmeyer 500ml

b.      Tambahkan 200 ml larutan HCl 3% didihkan selama 3 jam dengan pendingin tegak.

c.       Dinginkan dan netralkan dengan larutan NaOH 30% (dengan kertas lakmus atau fenolftalein) dan tambahkan sedikit CH₃COOH 3% agar suasana sedikit asam.

d.      Pindahkan isinya kedalam labu ukur 500 mL dan impitkan hingga tanda batas , kemudian saring.

e.       Pipet 10 mL saringan kedalam Erlenmeyer 500 mL, tambahkan 25 mL larutan Luff (dengan pipet) dan beberapa butir batu didih serta 15 mL air suling.

f.       Panaskan campuran tersebut dengan nyala yang tetap. Usahakan agar larutan dapat mendidih dalam waktu 3 menit (gunakan stop watch). Didihkan terus selama 10 menit dihitung dari saat mulai mendidih dan gunakan stop watch) kemudian dinginkan dalam bak yang berisi es.

g.       Setelah dingin tambahkan 15 mL larutan KI 20%, dan 25 mL H₂SO₄ 25% perlahan-lahan.

h.      Titer secepatnya dengan larutan tio 0,1 N (gunakan larutan indicator amilum0,5%)

i.        Kerjakan juga Blanko.

7.      Table data

a.       Standarisasi larutan tiosulfat 0,1 N

NO	W KIO3	V Na2S2O3 (mL)	N NA2S2O3	N Rata-rata

b.      Analisa sampel

Ws	V Na2S2O3 (mL)		Mg gula tabel	% KH	% rata-rata

8.      Perhitungan

                                           Mg gula  x  N tio/0,1 x fp   

Kadar karbohidrat   =                                                           x  100%  x 0,9

                                                                      Ws  x 1000

Ws                      =  bobot cuplikan (mg)

Mg gula              =  glukosa yang terkadang untul mL tio yang dipergunakan (mg)

                                Table Luff Schoorl

Fp                       =  factor pengenceran

I.STERILISASI

            Sterilisasi adalah suatu usaha untuk membebaskan alat-alat atau bahan-bahan dari segala macam bentuk kehidupan, terutama mikroba.

Dalam praktek sterilisasi alat-alat atau media dapat dikerjakan secara mekanik (misalnya dengan cara penyaringan), secara kimia (menggunakan desinfektan), atau secara fisik (dengan pemanasan, sinar Ultra violet, sinar X dan lain-lain).

Cara sterilisasi yang digunakan tergantung kepada macam dan sifat bahan yang disterilkan (misalnya ketahanan terhadap panas, bentuk bahan yang disterilkan : Padat, cair, atau gas).

1.      Sterilisasi Secara Fisik

Sterilisasi secara Fisik merupakan sterilisasi yang sering dipakai.Sterilisasi dengan cara ini ada 5 cara :

a.       Pemijaran

b.      Udara panas

c.       Uap air bertekanan

d.      Uap air panas

e.       Sinar Radio aktif

a.      Pemijaran

Cara ini dipakai untuk sterilisasi jarum platina/Ose yang terbuat dari Platina atau Nikrom. Caranya dengan membakar alat-alat etrsebut diatas lampu spirtus/Bunsen sampai pijar.

b.      Udara Panas/Kering

Alat yang dipakai adalah hot air sterilizer/ovin dipakai untuk sterilisasi alat-alat dari gelas seperti Erlenmeyer, petridish, tabung reaksi,pipet dan lain-lain. Bahan-bahan seperti kapas, kertas, kain juga dapat disterilkan dengan alat ini. Suhu yang digunakan berkisar 170 - 180° C selama 2 – 3 jam. Lamanya sterilisasi dengan cara ini tergantung pada jumlah alat-alat yang disterilkan dan ketahanannya terhadap panas.

c.       Uap Panas

Bahan-bahan yang disterilkan dengan cara ini umumnya adalah “ Media” yang tidak tahan terhadap “suhu tinggi” : alatnya disebut alat sterilisasi Arnold.

Caranya : Sterilkan bahan pada suhu 100° C selama 80 menit untuk mematikan sel vegetative mikroorganisme kemudian diinkubasikan selama 24 jam pada suhu kamar untuk menumbuhkan spora-spora. Ulangi cara tersebut untuk ke 3 kalinya pada bahan dengan suhu dan waktu yang sama.  Dengan cara ini diharapkan akan benar-benar menjadi steril.

d.      Uap Air Panas Bertekanan

Alat yang digunakan namanya “ autoklaf “ ( picesum cooker ) . Sterilisasikan dengan cara ini merupakan cara sterilisasi yang paling baik jika di bandingkan dengan cara – cara lainnya. Alat – alat dan bahan – bahan yang dapat di sterilkan dengan cara ini adalah alat – alat dan bahan – bahan yang tidak akan rusak karena pemanasan dan tekanan tinggi .

Caranya : autoklaf diisi air kira – kira 1,5-2 liter kemudian di panaskan . Alat dan bahan yang akan di sterilkan dimasukkan ke dalam autoklaf . Apabila media yang akan di sterilkan dalam tabung reaksi atau Erlenmeyer, perlu di tutup rapat dengan kapas kemudian di bungkus dengan sampul setelah itu tutup autoklaf , di pasang dan skrup – skrup nya di kencangkan . Keran pengatur tempat keluar nya uap air di biarkan terbuka sampai uap air keluar . Hal ini di maksud agar – agar di dalam alat – alat tersebut tidak ada udara lagi yang dapat mengacaukan pembacaan suhu atau tekanan , selanjutnya keran pengatur keluarnya uap air di tutup dan di biarkan sampai tekanan di dalam naik. Suhu atau tekanan yang digunakan tergantung dari alat/bahan yang digunakan adalah 15-20 psi ( 1,5 -2 atm ) dan waktu 15 – 30  menit . Apabila sterilisasi sudah selesai maka listrik / apinya dimatikan . Keran uap di biarkan sampai angka 0 baru kemudian autoklaf di buka .

2.      Sterilisasi Secara Mekanik

·         Saringan

Bahan – bahan cair yang sangat peka terhadap pemanasan ( misalnya : serum darah ) atau media cair yang relative tidak tahan terhadap pemanasan yang tinggi harus di sterilkan dengan cara penyaringan untuk keperluan ini dipakai alat yang disebut penyaring bakteri ( filter bakteri ) .

a.      Penyaring Bekefeld

Alat penyaringanya terbuat dari tanah diatomac dengan 3 porositas V ( Viet = Kasar ) ,N ( Normal ) , W ( Weing = halus ) yang biasa dipakai yang mempunyai porositas N dan W.

b.      Penyaring Chamberland

Alat saringannya terbuat dari porselen yang dilapisi email. Porositasnya filter L₁,L_2,L₃…,L₁₃.

Dimana : L₁              paling kasar

               L₂               paling halus

Yang biasanya dipakai L₃

c.       Penyaring Seitz (penyaring asbes)

Alat penyaring terbuat dari baja tahan karat yang dilengkapi dengan saringan asbes selulosa yang dapat diganti.

d.      Penyaring Mendler

Penyaring ini terbuat dari 60-80 % diatomae, 10-15 % plaster of paris (CaSO₄).H₂O.Perbandingan ini tergantung dari besar kecilnya pori yang diinginkan.

e.       Penyaring Fritted Glass

Penyaring ini terbuat dari serbik gelas (fritted glass) yang halus didalam cetakan yang berbentuk cakram (disk) kemudian dipanaskan sampai suhu tinggi sehingga cakram berpori. Porositasnya ada 5 tingkat yaitu

EC (ekstra kasar), C (kasar), M (medium), UF (ekstra halus), F (halus).

e.       Penyaring Asbes

Asbes ditekan menjadi bentuk cakram tipis dengan dijepit melalui logam yang rata.

f.        Penyaring Jenkin

Penyaring ini menggunakan lapisan logam karet penghubung dan balok penyaring yang terbuat dari porselen.

g.      Penyaring Ultra

Digunakan untuk memisahkan koloid-koloid. Penyaring Ultra menggunakan koloidon dan digunakan untuk memisahkan virus.

3.      Sterilisasi Secara Kimia

Bahan kimia yang sering digunakan adalah

a.      Fenol

Fenol dan turunannya (metal fenol dan dimetil fenol) bersifat merobek membrane sel dan mendenaturasikan protein, yang mengakibatkan mikroorganisme menjadi mati.

b.      Alkohol

Alkohol dapat mendenaturasikan protein dan melarutkan lemak sehingga dinding sel rusak dan plasma membengkak mengakibatkan mikroorganisme mati.Etanol sangat efektif pada konsentrasi 50-70%.

c.       Halogen

Jenis halogen yang sering digunakan untuk sterilisasi  adalah Yodium, dan klor serta senyawanya contoh kaporit (NaOCl).

Kepekaan dan Keaktifan zat kimia terhadap Mikroorganisme

NO	Bahan	Konsentrasi	Keaktifan
1.	Formalin + Alkohol	8 % + (60-70%)	Tinggi
2.	Formalin	3-8 %	Sedang tinggi
3.	Yodium tinklor	0,6 – 70 %	Sedang
4.	Alkohol	70 – 90 %	Sedang
5.	Kaporit	4 – 5 %	Sedang
6.	Fenol	0,5 – 3 %	Rendah sedang

II.               MEDIA

           Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara (nutrient) yang berguna untuk membiakkan mikroba. Dengan menggunakan berbagai media dapat dilakukan isolasi, perbanyakan, pengujian sifat-sifat fisiologis dan perhitungan jumlah mokroba.

Supaya mikroba dapt tumbuh dengan baik dalam suatu media maka suatu media harus memenuhi syarat-syarat antara lain :

1.      Harus mengandung semua zat hara yang mudah digunakan oleh  mikroba

2.      Harus mempunyai tekanan osmose, tegangan permukaan dan pH yang sesuai dengan    kebutuhan mikroba yang ditumbuhkan.

3.      Tidsk mengandung zat-zat yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba.

4.      Harus dalam keadaan steril sebelum digunakkan, agar mikroba yang diinginkan dapat tumbuh baik.

A.     Macam – Macam Media

Media dapat di golongkan berdasarkan atas  :

1.      Media berdasarkan susunan zat kimia

2.      Media berdasarkan sifatnya

3.      Media berdasarkan konsistensinya / wujudnya / fasa

4.      Media berdasarkan fungsinya / kegunaannya

1.      Media berdasarkan susunan zat kimia

a.       Media Anorganik yaitu media yang tersusun dari bahan-bahan anorganik

b.      Media Organik yaitu media yang tersusun dari bahan-bahan organic

c.       Media sintetik (media buatan) yaitu media yang susunan kimianya diketahui denhgan pasti, media ini umumnya digunakan untuk mempelajari kebutuhanmakanan suatu mikroorganisme contoh media Bushel HaS_2.

d.      Media non sintetik adalah media yang tidak diketahui pasti susunan kimianya dan biasanya terdiri dari bahan-bahan alami seperti kentang, nutrient kaldu, dan telur. Media ini biasanya digunakan untuk menumbuhkan dan mempelajari taksonomi mikroorganisme.

2.      Media berdasarkan sifatnya

a.       Media umum yaitu suatu media yang dapat digunakan untuk pertumbuhan dan perkembangan bermacam-macam mikroorganisme, contoh media kentang.

b.      Media khusus yaitu media yang hanya digunakan untuk menumbuhkan macam-macam nikroorganisme saja contoh EMB agar (Eosin Metyl Blue) untuk menumbuhkan Escherichia coli.

c.       Media Eklusif yaitu media yang hanya bias ditumbuhi oleh suatu jenis mikroorganisme sedang mikroorganisme lainnya mati.

3.      Media berdasarkan Konsistensinya / wujudnya / fasa

a.       Media cair yaitu media yang berbentuk cair

b.      Media Padat yaitu media yang berbentuk padat. Media ini dapat berupa bahan organi alamiah misalnya terbuat dari kentang, wortel, dengan ditambahkan agar-agar sebagai zat pemadat atau juga dari bahan anorganik masalnya silica gel.

c.       Media semi padat atau semi solid yaitu media padat yang dpat dicairkan. Media ini dalam keadaan panas berebntuk cair sedangkan dalam keadaan dingin berbentuk padat, contoh media agar dan media broth (kaldu).

4.      Media berdasarkan Fungsinya / Kegunaannya

Pembuatan media ini dimaksudkan untuk tujuan khusus yaitu pengenalan, perhitungan, dan isolasi mikroorganisme tipe-tipe tertentu. Contoh media ini antara lain :

a.       Media Diperkaya yaitu media yang ditambah dengan zat-zat tertentu misalnya serum darah, ekstrak tanaman. Media ini digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme yang bersifat heterotrof.

b.      Media Selektif yaitu media yang ditambahi zat kimia tertentu untuk mencegah pertumbuhan mikroorganisme lainnya atau media ini dapat memberikan nutrient yang cukup untuk prtumbuhan mikroorganisme lainnya yang tidak diharapkan contoh media yang mengandung Kristal violet untuk menumbuhkan bakteri Gram.

c.       Media Difrensial yaitu media yang ditambahi zat kimia tertentu yang menyebabkan suatu mikroorganisme membentuk pertumbuhan untuk mengadakan perubahan tertentu dapat dibedakan tipe-tipenya. Contoh media agar darah untuk membedakan baketri Hemolitik dan Nonhemolitik.

d.      Media Penguji (assay / asei) yaitu media dengan susunan tertentu yang digunakan untuk pengujian vitamin-vitamin, asam amino dan antibiotic.

e.       Media Perhitungan Jumlah Mikroorganisme yiatu media spesifik yang digunakan untuk menghitung jumlah mikroorganisme dalam suatu bahan.

Beberapa contoh media Diperkaya, Media Selektif, dan Media Difrensial

1.      Agar Darah / Blood Agar

Media Difrensial yang digunakan untuk membedakan beberapa bakteri pathogen, dan bakteri hemolitik.

2.      Endo Agar

Media yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri yang hidup diusus.

3.      EMB (Eosin Methylen Blue)

Media yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri yang termasuk golongan Entero Bakteriaceae dan campuran species-species bakteri berbentuk Koloform.

4.      Mac Conkey Agar

Digunakan untuk seleksi dan penumbuhan bakteri Entero bakteri dan bakteri gram.

5.      Brilliant Green Agar

Untuk menumbuhkan bakteri Gram, Enterobakteriaceae salmonella

6.      GLBB

Untuk menumbuhkan bakteri gram dan enterobakteriaceae

7.      Manitol Salt Agar (MSA)

Untuk mendeteksi asam yang dihasilkan oleh Staphylococcus.

8.      Axida Dextrose Broth (ADB)

Untuk bakteri Gram +

9.      Violet Red Bilentuk bakteri Gram –

10.  Salmonella Shigella Agar (SSA)

Untuk bakteri Gram – dan Enterobakteriaceae

11.  Selenit Broth untuk isolasi Salmonella

12.  Gram Negatif Broth (GNB)

Untuk menumbuhkan bakteri Salmonella dan Shigella

13.  Deoxycholate Citrat Agar (DCA) untuk mengisolasi spesies dari kelompok Enterobakteriaceae salmonella

14.  TSI (Triple Sugar Iron) untuk membedakan jenis Enterobakteriaceae.

LANGKAH - LANGKAH PEMBUATAN MEDIA

1.      Mencampur Bahan

Garam dan bahan-bahan lain dilarutkan dalam Aquades kemudian dipanaskan dalam penangas air sehingga larut.

2.      Menyaring Medium

Beberapa media kadang-kadang perlu disaring dengan kertas saring, kain dan kapas. Untuk media agar atau gelatin penyaringan harus dilakukan sewaktu media masih panas.

3.      Menentukan dan Mengatur pH

Penentuan pH suatu media cair dapat dilakukan secara kolori metri dengan menggunakan kertas indicator universal dan komparator blok secara potensiometrik menggunakan pH meter.

4.      Memasukkan Media Dalam Wadah

Sebelum media disterilkan kedalam tabung reaksi steril atau ketempat lain yang steril kemudian ditutup dengan kapas dan bagian kapasnya dibungkus kertas sampul (perkamen) supaya jangan basah waktu disterilkan.

5.      Sterilisasi Media

Sterilisasi tergantung pada jenis media yang digunakan.

Beberapa Media Yang Digunakan Untuk Identifikasi

A.     Endo Agar

Persenyawaan utama dalam media ini adalah Lactosa, Na Sulfit, Basicfuhsin. Sifat pertumbuhan pada koloni Endo Agar adalah untuk bakteri yang memfermentasikan Lactosa terlihat koloni berwarna merah metalikdan dikelilingi media yang berwarna kemerahan.Untuk bakteri yang tidak memfermentasikan Lactosa maka koloni terlihat warna terang, tembus tak berwarna dan dikelilingi oleh media yang berwarna merah

B.     Brilliant Green Agar

Media ini banyak digunakan untuk Isolasi dan Identifikasi Salmonella dari tinja dan bahan makanan. Indikator yang digunakan adalah fenol yang berwarna merah  dalam suasana basa dan berwarna kuning dalam suasana asam.

Sifat Pertumbuhan Koloni pada Agar

NO	Jenis Bakteri	Sifat Pertumbuhan Koloni
1.	Salmonella	Koloni berwarna merah muda dikelilingi oleh medium berwarna merah
2.	Proteus	Koloni berwarna merah tanpa penyebaran
3.	Pseudomonas	Koloni berwarna merah dengan permukaan menjorok kebagian dalam

III.            ISOLASI MIKROBA

Populasi mikroorganisme yang ada di alam sekitar kita ini ssangatlah besar dan cukup kompleks. Beratus spesies mikroba menguasai setiap bagian tubuh kita. Mereka terdapat dalam jumlah yang cukup basar.  Sebagai contoh, sekali kita bersin dapat menebarkan beribu- ribu mikroorganisme.  Satu gram tinja dapat mengandung jutaan bakteri. Alam di sekitar kita, baik itu tanah, air, maupun udara juga dihuni oleh kumpulan mikroorganisme Penelitian yang layak mengenai mikroorganisme dalam berbagai habitat ini memerlukan teknik untuk memisahkan populasi campuran yang rumit ini, atau yang biasanya dikenaldengan istilah biakan campuran, menjadi spsies yang berbeda- beda yang bikenal dengan istilah biakan murni. Biakan murni in teerdiri dari satu populasi sel yang semuanya berasal dari satu sel induk(Pelczar, 1986).

 Mikroorganisme dapat diperoleh dari lingkungan air, tanah, udara, suubstrat yang berupa bahan pangan, tanaman dan hewan. Jenis mikroorganismenya dapat berupa bakteri, khamir,kapang dan sebagainya. Populasi dari mikroba yang ada di linkungan ini sangatlah beraneka ragam sehingga dalam mengisolasi diperlukan beberapa tahap penanaman sehingga berhasil diperoleh koloni yang tunggal. Koloni yang tunggal ini kemudian yang akan diperbanyak untuk suatu tujuan penelitian misalnya untuk menngisolasi DNA mikroba yang dapat mendeteksi mikroba yang telah resisten terhadap suatu antibiotik. Atau untuk mengetahui mikroba yang dipakai untuk bioremediasi holokarbon (Ferdiaz, 1992). Pemindahan bakteri dari medium lama ke medium yang baru atau yang dikenal dengan istilah inokulasi bakteri ini memerluakn banyak ketelitian. Terlebih dahulu kita harus mengusahakan agar semua alat- alat yang akan digunakan untuk pengerjaan medium dan pengerjaan inokulasi benar- benar steril. Hal ini untuk menghindari terjadinya kontaminasi, yaitu masuknya mikrooba lain yang tidak diinginkan sehingga biakan yang tumbuh di dalam medium adalah benar-benar biakan murni (Dwidjoseputro, 1990). Di dalam keadaan yang sebenarnya dapat dikatakan bahwa tidak ada bakteri yang  hidup secara tersendiri terlepas dari spesies yang lainnya. Kerap kali bakteri patogen kedapatan bersama- sama dengan bakteri saprob. Untuk menyendirikan suatu spesies dikenal beberapacara, yaitu (Dwidjoseputro, 1990) :

1.      Dengan pengenceran

Cara ini pertama kali dilakukan oleh Lister pada tahun 1865. Ia berhasil memelihara Streptococcuslactis dalam piraan murni yang diisolasi dari sampel susu Yang sudah masam.

Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran bermacam- macam spesies diencerkan dalam suatu tabung yang tersendiri. Dari hasil pengenceran ini kemudian di ambil kira- kira 1 mL untuk diencerkan  lebih lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga ini diambil 0,1 mL untuk disebarkan pada suatu medium padat, kemungkinan besar kita akan mendapatkan beberapa koloni yang akan tumbuh dalam mdium tersebut, akan tetapi mungkin juga kita hanya akan memperoleh satu koloni saja. Dalam hal yang demikian ini dapat kita jadikan piaraan murni. Jika kita belum yakin, Bahwa koloni tunggal yang kita peroleh  tersebut  merupakan koloni yang murni, maka kita dapat mengulang pengenceran dengan menggunakan koloni ini sebagai sampel.

2.      Dengan penuangan

Robert Koch (1843- 1905) mempunyai metode yang lain, yaitu dengan mengambil sedikit sampel campuran bakteri yang mudah diencerkan, dan sampel ini kemudian di sebar di dalam suatu medium yang terbuat dari kaldu dan gelatin encer. Dengan demikian dia memperoleh suatu piaraan adukan. Setelah medium tersebut mengental maka selang beberapa jam kemudian nampaklah koloni- koloni yang masing- masing dapat dianggap murni. Dengan mengulang pekerjaan di atas, maka akhirnya akan diperoleh piaraan murni yang lebih terjamin.

Ada beberapa metode yang biasanya dilakukan untuk menanam biakan di dalam medium diantaranya adalah (Lay, 1994) :

1.  Metode cawan gores

Metode ini mempunyai dua keuntungan yaitu menghemat bahan dan waktu. Namun untuk memperoleh hasil yang baik diperlukan keterampilan yang lumayan yang biasanya diperoleh dari pengalaman. Metode cawan gores yang dilakukan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya mikroorganisme yang diinginkan. Dua macam kesalahan yang umum sekali dilakukan adalah tidak  memanfaatkan permukaan medium dengan sebaik- baiknya untuk digores sehingga pengenceran mikroorganisme menjafi kurang lanjut dan cenderung untuk menggunakan inokulum terlalu banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel- sel

yang digores.

2. Metode cawan tuang

Cara lain untuk mempeeroleh biakan koloni murni dari populasi campuran mikroorganisme ialah dengan mengencerkan eksperimen dalam medium agar yang telah dicairkan dan didinginkan yang kemudian di cawankan. Karena konsentrasi sel- sel mikroba di dalam eksperimen pada umumnya tidak diketahui sebelumnya, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap sehingga sekurang- kurangnyya satu di antara cawan – cawan tersebut mengandung koloni- koloni terpisah baik di atas permukaan maupun di dalam agar. Metode ini memboroskan waktu dan bahan namun tidak memerlukan keterampilan yang terlalu tinggi. Proses pemisahan/pemurnian dari mikroorganisme lain perlu dilakukan karena semua pekerjaan mikrobiologis, misalnya telaah dan identifikasi mikroorganisme, memerlukan suatu populasi yang hanya terdiri dari satu macam mikroorganisme saja. Teknik tersebut dikenal dengan Isolasai Mikroba.

Terdapat berbagai cara mengisolasi mikroba, menurut  (Admin, 2008) :

1)  Isolasi pada agar cawan

Prinsip pada metode isolasi pada agar cawan adalah mengencerkan mikroorganisme sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari organisme lainnya. Setiap koloni yang terpisah yang tampak pada cawan tersebut setelah inkubasi berasal dari satu sel tunggal. Terdapat beberapa cara dalam metode isolasi pada agar cawan, yaitu:

·      Metode gores kuadran, dan metode agar cawan tuang

·      Metode gores kuadran. Bila metode ini dilakukan dengan baik akan menghasilkan terisolasinya mikroorganisme, dimana setiap koloni berasal dari satusel.

·      Metode agar tuang. Berbeda dengan metode gores kuadran, cawan tuang menggunakan medium agar yang dicairkan dan didinginkan (50^oC), yang kemudian dicawankan. Pengenceran tetap perlu dilakukan sehingga pada cawan yang terakhir mengandung koloni-koloni yang terpisah di atas permukaan/di dalam cawan.

 2)  Isolasi pada medium cair

Metode isolasi pada medium cair dilakukan bila mikroorganisme tidak dapat tumbuh pada agar cawan (medium padat), tetapi hanya dapat tumbuh pada kultur cair. Metode ini juga perlu dilakukan pengenceran dengan beberapa serial pengenceran. Semakin tinggi pengenceran peluang untuk mendapatkan satu sel semakin besar.

  3) Isolasi sel tunggal

Metode isolasi sel tunggal dilakukan untuk mengisolasi sel mikroorganisme berukuran besar yang tidak dapat diisolasi dengan metode agar cawan/medium cair. Sel mikroorganisme dilihat dengan menggunakan perbesaran sekitar 100 kali. Kemudian sel tersebut dipisahkan dengan menggunakan pipet kapiler yang sangat halus ataupun micromanipulator, yang dilakukan secara aseptis.

LEMBAR KERJA VIII

JUDUL                         :    Teknik Isolasi Mikroba

ALAT DAN BAHAN

1.       Alat

Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah cawan petri, bunsen, enkas, ikubator, ose dan mikropipet.

2.       Bahan

Bahan yang dipergunakan pada percobaan ini adalah Biakan Escherichia coli, Biakan Staphylococcus aureus, biakan Lactobacillus, Larutan tanah, medium nutrient agar padat, aquadest, spiritus, alkohol, swab dan korek api

 Cara Kerja

 Adapun cara kerja dari percobaan ini adalah :

1. Isolasi mikroba di sekitar kita

o   Cawan petri yang berisi medium NA diberi label masing- masing sesuai perlakuan.

o   Kemudian dengan menggunakan swab, mengambil kotoran gigi, kotoran belakang 

o   Sebelum dilakukan pengerjaan dalam enkas, terlebih dahulu mensterilkan tangan dengan menggunakan alkohol 70%.

o   Setelah itu masing- masing sampel dimasukkan ke dalam cawan petri yang telah berisi medium NA.

o   Melidahapikan mulut/ pinggir cawan petri dengan maksud agar bakteri yang melekat mati.

o   Kemudian membungkus cawan petri dengan menggunakan kertas lalu menginkubasi ke dalam inkubator selama 24- 48 jam. Mengamti perubahan yang terjadi.

2. Isolasi mikroorganisme dari substrak cair

o   Cawan petri yang berisi medium NA diberi label masing- masing sesuai perlakuan. Lalu memasukkannya kedalam enkas bersama dengan Biakan Escherichia coli, Staphylococcus aureus, dan Lactobacillus pada media cair.

o   Sebelum melakukan pengerjaan dalam enkas, terlebih dahulu mensterilkan tangan dengan mengunakan alkohol 70%.

o   Mengambil masing- masing biakan bakteri dengan menggunakan mikropipet sebanyak 0,1 mL, lalu diratakan pada permukaan medium sesuai dengan label.

o   Melidahapikan mulut/ pinggir cawan petri dengan maksud agar bakteri yang melekat mati.    

 3. A.Isoalsi dengan cara penuangan

o   Cawan petri steril, masing- masing diberi label sesuai perlakuan lalu meletakkan di dalam enkas bersama dengan medium NA yang cair.

o   Sebelum melakukan pengerjaan dalam enkas, terlebih dahulu mensterilkan tangan dengan mengunakan alkohol 70%.

o   Mengambil masing- masing biakaan bakteri dengan menggunakan mikropipet sebanyak 1 mL.

o   Melidahapikan cawan petri terlebih dahulu kemudian memasukkan biakan bakteri ke dalam cawan petri steril lalu menuangkan medium NA cair.

o   Menutup cawan petri kemudian melidahapikan dann menggoyangkan dengan cara memutar agar merata.

o   Medium setelah padat lalu menginkubasi sdelama 24- 28 jam dengan posisi terbalik pada suhu 37°C.

3.   B. Isolasi dengan cara taburan

o   Cawan petri yang berisi medium NA masing- masing diberi label sesuai perlakuan,lalu meletakkannya di dalam enkas.

o   Sebelum melakukan pengerjaan dalam enkas, terlebih dahulu mensterilkan tangan dengan mengunakan alkohol 70%.

o   Dengan menggunakan ose lurus, mengambil biakan bakteri lalu menaburkannya di atas medium NA padat secara merata.

o   Menutup cawan petri lalu melidahapikan dan membungkus dengan kertas, menginkubasi selama 24-28 jam dengan posisi terbalik pada suhu 37°C.

 4. Isolasi mikroorganisme dari substrak padat

o   Memasukkan cawa petri steril ke dalam enkas, kemudian sebelum melakukan pengerjaan dalam enkas, terlebih dahulu mensterilkan tangan dengan mengunakan alkohol 70%.

o   Mengambil larutan tanah yang telah homogen dengan menggunakan mikropipet lalu memasukkannya ke dalam cawan petri steril lalu menuangkan medium NA.

o   Menutup cawan petri lalu melidahapikan dan membungkus dengan kertas, menginkubasi selama 24-28 jam dengan posisi terbalik pada suhu 37°C.

  5. Isolasi bakteri dari kultur campuran

o   4 buah tabung reaksi yang masinng- masing berisi 2 medium agar tegak dan 2 medium agar mirig dimasukkan ke dalam enkas, setelah diberi label.

o   Sebelum melakukan pengerjaan dalam enkas, terlebih dahulu mensterilkan tangan dengan mengunakan alkohol 70%.

o   Dengan menggunakan ose lurus, mengambil biakan bakteri lalu menusukkan ke dalam medium lalu di tutup.

o   Dengan mengunakan ose bulat, mengambil biakan bakteri dan masing- masing digoreskan secara zig- zag pada medium agar miring lalu di tututp

o   Membungku tabung reaksi dengan kertas dan menginkubasinya selama 24- 72 jam dan mengamati masing- masing perbedaannya.  

IV.              PENGUJIAN AIR  

Air merupakan sumber kehidupan bagi mahluk hidup tidak terkecuali bagi Mikroba. Air untuk keperluan keluarga dan industry khususnya industry pangan mempunyai persyaratan tertentu, diantaranya adalah tidak boleh mengandung bakteri pathogen yang dapat diuji secara Mikrobiologis.

Disamping untuk keperluan rumah tangga dan industry, air yang bersal dari limbah industrypun

Harus diteliti dan diuji agar tidak menimbulkan pencemaran bagi daerah sekitarnya.

Air mempunyai peranan yang sangat penting bagi kehidupan umat manusia dan fungsinya bagi kehidupan tidak pernah dapat digantikan oleh senyawa lain.  Tubuh manusia terdiri dari 65% air atau sekitar 47 liter air / orang dewasa. Setiap hari sebanyak 2,5 liter air harus diganti dengan air yang baru.  Diperkirakan dari sejumlah air yang harus diganti sebanyak 1,5 liter berasal dari air minum dan sekitar 1,0 liter berasal dari bahan makanan yang dikonsumsi.

Karena air merupakan bagian terpenting bagi kehidupan manusia maka persyaratan mutu air yang pantas diminum perlu ditelaah, demikian pula air limbah industry, perlu diperiksa keadaannya sebelum dibuang  ke sungai atau perairan bebas lain. Dalam hal ini pengujian air secara mikrobiologis perlu dilakukan agar air terbebas dari mikroba.

1.      UJI KOLIFORM

Bakteri koliform digunakan sebagai indicator adanya polusi kotoran dan kondisi sanitasi terhadap air,susu dan makanan dan minuman lainnya. Adanya bakteri koliform dalam makanan atau minuman menunjukkan kemungkinan adanya mikroorganisme yang bersifat enteropatogenik atai enterotoksigenik yang berbahaya bagi kesehatan.

Untuk mengetahui koliform dalam suatu contoh biasanya digunakanmetode MPN (Most Probable Number) dengan cara fermentasi tabung ganda.  Metode ini lebih baik disbandingkan dengan metode hitung cawan TPC (Total Plate Count) karena lebih sensitive dan dapat mendeteksi koliform dalam jumlah yang sangat rendah dalam contoh.  Uji kualitattif koliform secara lengkap terdiri dari :

a.       Uji Penduga

b.      Uji Penguat

c.       Uji Lengkap

Uji penduga juga merupakan uji kuantitatif koliform menggunakan metode MPN

a.      Uji Penduga Koliform (MPN Koliform)

Ada dua cara yang dapat digunakan dalam menghitung MPN koliform secara sensitif dalam air, yaiyu metode 7 tabung dan 15 tabung.  Pengambilan contoh pada metode ini sebanyak 10 mL untuk tabung seri pertama, terutama untuk contoh-contoh yang diduga kandungan koliformnya kecil, sehingga apabila contoh yang diambil terlalu ktode ini sebanyak 10 mL untuk tabung seri pertama, terutama untuk contoh-contoh yang diduga kandungan koliformnya kecil, sehingga apabila contoh yang diambil terlalu kecil mungkin koliformnya tidak dapat terdeteksi.

Jumlah contoh pertabung	Jumlah tabung durham + Tabung durham	Jumlah medium pertabung
MPN 7 tabung 10 mL 1,0 mL 0,1 mL	5 1 1	10 mL (konsentrasi ganda ) 10 mL (konsentrasi ganda) 10 mL (konsentrasi ganda)
MPN 15 tabung 10 mL 1,0 mL 0,1 mL	5 5 5	10 mL (konsentrasi ganda) 10 mL (konsentrasi ganda) 10 mL (konsentrasi ganda)

Untuk analisa air, dalam uji penduga digunakan medium lactose broth (kaldu laktosa). Inkubasi dilakukan pada suhu 35 derajat. Celcius selama 24 jam, dan tabung dinyatakan positif jika terbentuk gas sebanyak 10% atau lebih dari volume di dalam tabung durham.  Tabung yang tidak menunjukkan pembentukan gas diperpanjang lagi inkubasinya selama 48 jam. Jika tetap tidak terbentuk gas , dihitung sebagai tabung nrgatif.  Jumlah tabung yang positif dihitung pada masing-masing seri.

b.      Uji Penguat Koliform ( MPN Penguat)

Terbentuknya gas dalam Lactose broth tidak selalu menunjukkan jumlah bakteri koli karena mikroba lainnya juga ada yang memfermentasi lactose dengan membentuk gas, seperti bakteri asam lactate dan beberapa khamir tertentu. Oleh karena itu perlu dilakukan uji penguat pada agar EMBA (eosin methylene blue agar) dengan menggunakan jarum ose contoh dari tabung MPN yang menunjukkan uji penduga positif (terbentuk gas) masing-masing diinokulasikan pada agar cawan EMBA dengan cara goresan kuadran. Semua cawan diinkubasikan pada suhu 35^oC selama 24 jam. Jumlah cawan EMBA pada masing-masing pengenceran yang menunjukkan adanya koliform dihitung.

c.       Uji Lengkap Koliform

Dari pertumbuhan koloni pada agar cawan EMBA dipilih masing-masing koloni yang mewakili koloni fekal (mempunyai diameter 0.5 – 1,0 mm dan berwarna gelap dengan sinar hijau metalik / keemasan), dan satu koloni yang mewkili koliform non fekal (diameter 1,0 – 3, 0 mm, berwarna merah muda dan bagian tengah berwarna gelap seperti mata ikan).

Uji lengkap dilakukan untuk melihat apakah isolate diambil benar merupakan bakteri koliform. Dari masing-masing koloni dibuat pewarnaan gram dan sisanya masing-masing dilarutkan kedalam 3 mL larutan pengencer steril. Dari  suspense bakteri tersebut diinokulasikan dengan menggunakan jarum ose kedalam tabung berisi lactose broth dan tabung durham dan digoreskan pada agar miring Nutrien Agar (NA). tabung diinkubasikan pada suhu 35^oC selama 24 jam dan 48 jam, dan diamati adanya pertumbuhan  dan pembentukan gas didalam lactose broth. Koloni yang menunjukkan reaksi pewarnaan gram negative berbentuk batang dan membentuk gasdidalam lactose broth merupakan uji lengkap adanya koliform.

Untuk mengetahui adanya bakteri koliform pada bahan atau contoh pengujian cukup sampai disini, akan tetapi jika akan dideteksi jenis koliform yang ada dalam contoh bisa dilakukan uji IMVIC (Indol Methyl, Voges – Proskaeur, dan Citrate).

LEMBAR KERJA IX

JUDUL                                        :     Pengujian Kualitas Air Secara Uji Koliform

TUJUAN                                     :     Menguji kualitas air dengan menggunakan metode

                                                           MPN (Most Probable Number)

ALAT DAN BAHAN                  :     1. ALAT

·         Tabung reaksi

·         Tabung durham

·         Jarum ose

·         Cawan petri

·         Incubator

·         Kaca preparat

·         Lampu spiritus

·         Mikroskop

·         Botol pengencer

                                                     :   2. BAHAN      

·         Medium lactose cair

·         Medium EMBA

·         Contoh air

·         Larutan cristal violet

·         Larutan mordan

·         Alcohol 95%

·         Larutan safranin

·         Aquadest

·         Kertas tisu/isap

KESELAMATAN KERJA

Pakailah jas praktikum selama praktek dilakukan. Bekerjalah secara aseptis selama kegiatan praktek karena bekerja dengan menggunakan bakteri yang bersifat pathogen dan jagalah selalu alat-alat  dan area kerja dalam keadaan bersih dan setelah selesai maka, alat-alat kerja dan area kerja,serta tangan harus dibersihkan agar tidak terkontaminasi oleh bakteri tersebut. Buang semua bahan / media yang tidak digunakan lagi pada tempat yang disediakan.

CARA KERJA

Uji Penduga Koliform (MPN Koliform)

1.      Ambilah 7 buah tabung reaksi berisi media lactose cair + tabung durham

2.      5 buah tabung ditambah 10 mL  contoh air. air, 1 tabung ditambah 0,1 mL.

3.      Inkubasikan pada suhu 35^oC selama 24 jam. Tabung dinyatakan positif jika terbentuk gas dalam tabung durham. Tabung yang tidak menunjukkan pembentukan gas diperpanjang lagi inkubasinnya sampai 48 jam, jika tetap tidak terbentuk gas dihitung sebagai tabung negative.

Uji Penguat Koliform

1.      Dengan jarum ose, contoh dari tabung MPN yang menunjukkan uji penduga positif (terbentuk gas) masing-masing diinikulasikan pada cawan yang berisi media EMBA dengan goresan kuadran.

2.      Inkubasikan pada suhu 35^oC selama 24 jam.

3.      Amati pertumbuhan pada cawan petri.

Uji Lengkap Koliform

1.      Dari pertumbuhan pada agar cawan EMBA, dipilih masing-masing satu koloni yang mewakili koliform fekal dan koliform nonfekal.

2.      Dari masing-masing koloni dibuat pewarnaan Gram,dan sisanya masing-masing dilarutkan kedalam 3 mL larutan pengencer steril.

3.      Dari suspense bakteri tersebut masing-masing diinokulasikan dengan menggunakan jarum ose kedalam tabung yang berisi lactose cair dan tabung durham.

4.      Tabung diinkubasikan pada suhu 35^oC selama 24 jam dan 48 jam, dan diamati adanya pembentukan gas dalam lactose cair.

5.      Koloni yang menunjukkan reaksi pewarnaan gram negative berbentuk batang dan membentuk gas didalam lactose cair merupakan uji lengkap adanya koloni koliform.

ZAT – ZAT ADITIF PADA MAKANAN

Bahan makanan yang diproses secara besar-besaran dalam industry umumnya ditambahkan zat zat tertentu kedalamnya. Penambahan zat –zat itu dilakukan dengantujuan tertentu , misalnya :

a.       Untuk meningkatkan mutu. Karena dikhawatirksn terjadinya kerusakanzat-zat yang ada dalam bahan selama dalam pemrosesan,maka ditambahkan vitamin-vitamin tertentu.

b.      Menyedapkan rasa dan memberi aroma.

c.       Untuk menghambat proses pembusukan.

d.      Memberi warna agar bahan makanan menjadi lebih menarik dan Nampak masih segar.

Zat-zat atau campuran zat yang ditambahkan dalam bahan makanan  waktu pembuatan, penyimpanan, dan pengepakan disebut zat aditif.

Penambahan zat –zat aditif pada makanan diperbolehkan selama zat-zat yang ditambahkan ini tidak membahayakan dan tidak merugikan pemakai. Beberapa fungsi zat aditif yang sering digunakan pada bahan makanan antara lain :

1.      Pengawet

Pengawet adalah yang ditambahkan pada pada bahan makanan agar makanan tetap segar, baud an rasa tidak berubah. Zat-zat yang sering digunakan sebagai pengawet antar lain :

a.      Butil Hidroksi Anisola (BHA) dan Butil Hidroksi  Toluena (BHT).

BHA dan BHT ditambahkan pada makanan kaleng sebagai  zat anti oksidan, bertujuan untuk mencegah terjadinya peristiwa oksidasi oleh oksigen di udara. Penambahan BHA dan BHT pada kentang menyebabkan kentang lebih tahan lama.

b.      Natrium Benzoat, asam benzoate, asam propionate, gas SO2. Zat-zat ini dapat mencegah pembusukan karena mikroba-mikroba. Asam benzoate dan asam propionate dapat membantu member rasa asam pada makanan, misalnya sari buah,. Natrium benzoat dapat menyebabkan warna daging tetap merah segar (tidak pucat).

2.      Pemberi rasa (penyedap rasa)

Pemberi rasa atau pnyedap rasa ialah zat yang ditambahkan pada makanan agar makanan lebih sedap rasanya atau mwemberi rasa tertentu misalnya pemanis. Zat-zat yang biasa digunakan sebagai pemberi rasa antara lain :

a.      Monosodium Glutamat (MSG)

Zat ini ditambahkan pada makanan untuk member rasa gurih  pada makanan. MSG misalnya terdapat pada vetsin.

b.      Sakarin, Dulsin, dan Natrium Siklamat

Zat-zat ini ditambahkan pada makanan untuk member rasa manis sebagai pengganti gula tebu. Sakarin mempunyai derajat kemanisan 500 x gula tebu. Dulsin mempunyai derajat kemanisan 250 x gula tebu.

c.       Penambah Aroma

Zat-zat yang digunakan kedalam makanan agar aroma dari makanan tetap seperti masih segar. Hal ini dapat terjadi karena mungkin dalam proses pengolahan aroma aslinya menjadi hilang atau berkurang. Sering pula zat penambah aroma dimasukkan dalm makanan untuk tiruan saja.Umumnya  zat-zat penambah aroma yang sering digunakan adalah senyawa-senyawa dari golongan Ester.

d.      Penambah Gizi

Zat-zat yang ditambahkan disini bertujuan untuk meningkatkan nilai gizi dari bahan makanan. Hal ini dapat terjadi karena mungkin dalam proses pengolahan mineral-mineral dari vitamin yang ada pada makanan tersebut terbuang atau terurai karena pencucian dan sebagainya. Zat aditif yang ditambahkan untuk meningkatkan nilai gizi bahan makanan antara lain :

Ø  Vitamin A, B, D, misalnya pada susu

Ø  Vitamin C pada sari buah

Ø  Mineral-mineral tertentu seperti Ca²⁺, Mg²⁺, Fe³⁺ pada berbagai jenis minuman atau makanan kaleng

Ø  Yodium pada garam

e.       Pewarna

Zat pewarna ditambahkan pada makanan / minuman dengan tujuan menambah daya tarik pada konsumen. Zat pewarna yang sering digunakan pada makanan hasil industry dibedakan menjadi :

1.      Bahan  Pewarna Alami

Bahan pewarna ini diperoleh dari tumbuh-tumbuhan (nabati ) seperti warna hijau dari klorofil (daun suji), warna coklat dari gula yang dihanguskan, warna ungu dari kulit anggur, warna kuning dari wortel, dan lain-lain.Umumnya zat pewarna alami tidak menimbulkan efek samping yang merugikan pemakai.

2.      Bahan Pewarna Sintesis

Bahan pewarna sintesis yaitu bahan pewarna yang dibuat manusia. Ada 8 zat warna yang diperkenankan oleh badab FDA (Food and Drug Administration) yaitu :

1.      Alluna merah

2.      Eritrosin

3.      Biru brilian FCF

4.      Indigo karmin

5.      Kuning sumzet

6.      Tartrazin

7.      Hijau fast FCF

8.      Benzyl violet

Pemakaian zat warna yang berlebihan dapat membahayakan pemakainya . Diduga pemakaian zat warna yang berlebihan dapat menimbulkan Karsinogen (penyebab kanker) Tentu saja ke- 8 zat pewarna yang diperkenankan untuk dipakai telah diuji sebelumnya dan dinyatakan tidak membahayakan pemakainya.

f.        Pengatur pH

Salah satu factor yang menentukan stabil atau tidaknya komponen zat-zat dalam makanan adalah pH dari cairan dalam makanan tersebut. Zat biasa yang digunakan untuk menstabilkan pH larutan pada makanan adalah Natrium Karbonat.